實(shí)驗(yàn)原理

堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA與線性的染色體DNA片段在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來(lái)分離它們。在堿性環(huán)境中，細(xì)菌染色體DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)變性，而質(zhì)粒DNA的氫鍵雖斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍相互盤繞處于結(jié)合纏繞狀態(tài)。將溶液的pH調(diào)至中性并在高鹽存在的條件下，染色體DNA、大分子量的RNA和蛋白質(zhì)在SDS（十二烷基硫酸鈉）的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過(guò)離心，可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，而質(zhì)粒DNA留在上清液中，通過(guò)酚/氯仿抽提純化得到質(zhì)粒DNA。

實(shí)驗(yàn)器材

恒溫培養(yǎng)箱、臺(tái)式恒溫?fù)u床、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、高速離心機(jī)、移液器、移液器吸頭、三角瓶、1.5ml離心管、離心管架、帶有pUC19質(zhì)粒的大腸桿菌等。

實(shí)驗(yàn)試劑

(1)無(wú)水乙醇。

(2)LB培養(yǎng)基(1L)：稱量胰蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，氯化鈉5.0g溶于800ml蒸餾水中，用1mol/L氫氧化鈉溶液（或1mol/L鹽酸溶液）調(diào)節(jié)pH至7.0，然后加蒸餾水至1000ml，高溫高壓滅菌后備用。

(3)質(zhì)粒小提試劑盒（離心柱型），試劑盒的產(chǎn)品組成如下：

1）平衡液BL。

2）溶液P1：50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0)。

3）溶液P2：0.2mol/L NaOH，1%SDS。

4）溶液P3：稱取29.4g乙酸鉀和11.5ml冰乙酸混合，加H2O至100ml。

5）去蛋白液PD。

6）漂洗液PW。

7）洗脫緩沖液EB。

8）RNase A。

9）吸附柱CP3。

10）2ml收集管。

實(shí)驗(yàn)操作

(1)接一環(huán)新鮮菌體于5ml含有適當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，37℃搖床(200rpm)過(guò)夜培養(yǎng)。

(2)柱平衡步驟：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。

(3)將1.5ml過(guò)夜培養(yǎng)菌液放于離心管中，12000rpm離心1min，棄去上清液，收集菌體。

(4)向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液P1，使用移液器吹打徹底懸浮菌體沉淀，使菌體懸浮均勻。

(5)向離心管中加入250μl溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，使菌體充分裂解，菌液變得清亮黏稠。

(6)向離心管中加入350μl溶液P3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6～8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min。

(7)用移液器吸出步驟(6)收集的上清液，轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，注意盡量不要吸出沉淀，12000rpm離心10min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重復(fù)操作步驟(8)。

(10)將吸附柱CP3放入收集管中，12000rpm離心2min，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除。

(11)將吸附柱CP3置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50～100μl洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，12000rpm離心2min，將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

注意事項(xiàng)

(1)溶液P1在使用前先檢查是否已加入RNase A，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)置于2～8℃環(huán)境中保存。

(2)溫度較低時(shí)，溶液P2會(huì)出現(xiàn)白色沉淀，可在37℃水浴中加熱幾分鐘，搖勻后使用。

(3)注意離心機(jī)的平衡問(wèn)題，所有離心步驟均為使用常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)在室溫下進(jìn)行離心。

實(shí)驗(yàn)意義

質(zhì)粒是共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA，在基因工程中，質(zhì)粒是目的基因的載體。從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA在分子生物學(xué)上是一種最基本的方法。